一、目的

淀粉一般都是直鏈淀粉和支鏈淀粉的混合物。直鏈淀粉和支鏈淀粉含量和比例因植物種類而不同，決定著谷物種子的出飯率和食味品質(zhì)，并影響著谷物的貯藏加工。通過本實驗學習掌握雙波長測定谷物中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量。

二、原理

根據(jù)雙波長比色原理，如果溶液中某溶質(zhì)在兩個波長下均有吸收，則兩個波長的吸收差值與溶質(zhì)濃度成正比。

直鏈淀粉與碘作用產(chǎn)生純藍色，支鏈淀粉與碘作用生成紫紅色。如果用兩種淀粉的標準溶液分別與碘反應(yīng)，然后在同一個坐標系里進行掃描（ 400 - 960 mm） 或做吸收曲線，可以得到圖所示結(jié)果。

圖 作圖法選擇淀粉的測定波長

圖中 1 為直鏈淀粉的吸收曲線， 2 為支鏈淀粉的吸收曲線。對含有直鏈淀粉和支鏈淀粉的未知樣品，與碘顯色后，只要在選定的波長λ1 ，λ 2 ， λ 3 ，λ 4 ，處作 4 次比色，利用直鏈淀粉和支鏈淀粉標準曲線即可分別求出樣品中兩類淀粉的含量。

三、儀器、試劑和材料

1. 儀器

（1） 電子分析天平

（2 ）索氏脂肪抽提器 1 套

（3 ）美析儀器分光光度計 1 臺

（4 ） pH 計

（5 ）容量瓶 100ml X 2 ， 50ml X 16

（6 ）吸管 0.5ml X 1， 2ml X 1， 5ml X 1

2. 試劑

（ 1） Ether或石油醚（沸程 30-60 ℃）

（2 ）無水乙醇

（ 3 ） 0.5 ml / L KOH 溶液

（ 4 ） 0.1 mol / L HCl 溶液

（5） 碘試劑：稱取碘化鉀 2.0g， 溶于少量蒸餾水，再加碘 0.2g， 待溶解后用蒸餾水稀釋定容至 l00ml.

（6） 直鏈淀粉標準液：稱取直鏈淀粉純品 0.1000g， 放在 100ml 容量瓶中，加入 0.5mol/ L KOH 10ml， 在熱水中待溶解后，取出加蒸餾水定容至 100ml， 即為 1mg/ml 直鏈淀粉標準溶液。

（7） 支鏈淀粉標準液：用 0.1000g 支鏈淀粉按 （6） 法制備成 1mg/ml 支鏈淀粉標準溶液。

3. 材料

供試谷物粉。

四、操作步驟

1 .選擇直鏈、支鏈淀粉測定波長、參比波長。

直鏈淀粉：取 1mg/ml 直鏈淀粉標準液 1ml， 放入 50ml 容量瓶中，加蒸餾水 30ml， 以 0.1 mol/ L HCl 溶液調(diào)至 pH 3.5 左右，加入碘試劑 0.5ml， 并以蒸餾水定容。靜置 20min ，以蒸餾水為空白，用雙光束分光光度計進行可見光全波段掃描或用普通比色法繪出直鏈淀粉吸收曲線。

支鏈淀粉：取 1 mg/ml 支鏈淀粉標準液 1ml， 放入 50ml 容量瓶中，以下操作同直鏈淀粉。在同一坐標內(nèi)獲得支鏈淀粉可見光波段吸收曲線。

根據(jù)原理部分介紹的方法，確定直鏈淀粉和支鏈淀粉的測定波長、參比波長λ 2 、λ 1 、λ 4 和λ 3 。

2 .制作雙波長直鏈淀粉標準曲線：吸取 1mg/ml 直鏈淀粉標準溶液 0.3 、 0.5 、 0.7 、 0.9 、 1.1 、 1.3 ml 分別放入 6 只不同的 50ml 容量瓶中，加入蒸餾水 30ml ，以 0.1 mol/ L HCl 溶液調(diào)至 pH 3.5 左右，加入碘試劑 0.5 ml， 并用蒸餾水定容。靜置 20min， 以蒸餾水為空白，用 1cm 比色杯在λ 1、λ 2 兩波長下分別測定 A λ 1，A λ 2 即得△ A 直 = A λ1  - A λ 2 以△ A 直為縱坐標，直鏈淀粉含量（mg ）為橫坐標，制備雙波長直鏈淀粉標準曲線。

3 .制作雙波長支鏈淀粉標準曲線：吸取 1mg/ml 支鏈淀粉標準溶液 2.0， 2.5 、 3.0 、 3.5 、 4.0 、 4.5 分別放入 6 只不同的 50ml 容量瓶中。以下操作同直鏈淀粉。以蒸餾水為空白，用 1cm 比色杯在λ 3 ，λ 4 兩波長下分別測定其 A λ 3，A λ 4 即得△ A 支 = A λ 4- A λ 3。以△ A 支為縱坐標，支鏈淀粉含量（mg ）為橫坐標，制備雙波長支鏈淀粉標準曲線。

4. 樣品中一直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉的測定：樣品粉碎過 60 目篩，用Ether脫脂，稱取脫脂樣品 0.1g 左右（至 1mg ），置于 50ml容量瓶中。加 0.5 mol/ L KOH 溶液 10ml， 在沸水浴中加熱10min， 取出，以蒸餾水定容至 50ml 若有泡沫采用乙醇消除），靜置。吸取樣品液 2.5ml 兩份（即樣品測定液和空白液），均加蒸餾水 30ml， 以 0.1mol/LHCI 溶液調(diào)至 pH 3.5 左右，樣品中加入碘試劑 0.5ml， 空白液不加碘試劑，然后均定容至 50ml 。靜置 20min ，以樣品空白液為對照，用 1cm 比色杯，分別測定λ 2， λ 1， λ 4， λ 3 的吸收值 A λ 2， A λ 1， A λ 4， A λ 3。得到△ A 直 = A λ 2 - A λ 1 ，△ A 支=A λ 4-A λ 3 。 分別查兩類淀粉的雙波長標準曲線，即可計算出脫脂樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。二者之和等于總淀粉含量。

五、結(jié)果處理

式中， X1 一查雙波長直鏈淀粉標準曲線得樣品液中直鏈淀粉含量（mg）

X2 一查雙波長支鏈淀粉標準曲線得樣品液中支鏈淀粉含量（mg）

m 一樣品質(zhì)量 （g）

總淀粉（%）= 直鏈淀粉（%）+支鏈淀粉（%）

六、注意事項

因蠟質(zhì)和非蠟質(zhì)支鏈淀粉碘復(fù)合物顏色差異較大，在制備雙波長支鏈淀粉曲線時，應(yīng)根據(jù)測定的谷物類型選擇不同支鏈淀粉純品（蠟質(zhì)或非蠟質(zhì)型）。

七、思考題

1. 雙波長法測定谷物中直鏈、支鏈淀粉的原理是什么？

2. 除了雙波長法外，比色法（ 620nm ）和安培滴定法也能分別測定直鏈和支鏈淀粉。了解其原理，比較不同方法的優(yōu)缺點。